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上海遠慕生物科技有限公司

PCR測定支原體實驗步驟
點擊次數(shù):688 更新時間:2023-05-04

實驗材料: Taq DNA多聚酶引物 陽性對照 DNA脫氧核苷三磷酸 混合物三磷酸 瓊脂糖1.3%TAE膠

試劑、試劑盒: 磷酸緩沖鹽溶液液 Tris醋酸 EDTA6×加樣緩沖液 引物儲備液

儀器、耗材: DNA抽提和純化系統(tǒng)基質(zhì)的DNA抽提試劑盒 熱循環(huán)儀

實驗步驟

一、DNA 標本的收集和制備

1. 需要檢測支原體污染的細胞系,在收集樣品前數(shù)天或至少在解凍后兩周內(nèi),不能加任何抗生素。應(yīng)保證支原體在培養(yǎng)上清中的效價在 PCR 測定范圍之內(nèi)。

2. 收集 1 ml 貼壁細胞或懸浮細胞的培養(yǎng)上清液。這樣收集的標本包含活的或死的細胞,其優(yōu)點是一些支原體會明顯地黏附在真核細胞上,甚至侵入細胞中。上清液可貯存在4°C 數(shù)天或 -20°C 數(shù)周。在樣品溶化后,應(yīng)立即操作。

3. 上清液在 13000 g 離心 5 min,將沉淀用 1 ml D-PBSA (D-PBSA (磷酸緩沖鹽溶液液):137 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,8.1 mmol/L Na2HPO4,1.5 mmol/L KH2PO4,pH 7.2;121℃,20 min 高壓滅菌)重懸浮,渦旋混勻。

4. 再次離心懸浮液,用 D-PBSA 沖洗一次以上,如步驟3。

5. 離心后的沉淀用 100 μl D-PBSA 重新懸浮,渦旋混勻,然后加熱至90°C,15 min。

6. 在分解細胞后,采用標準酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法或其他 DNA 抽提方法立即抽提 DNA 。

二、PCR 反應(yīng)

建立規(guī)則以避免 DNA 加入過多,嚴格按照以下步驟進行:

①DNA 抽提的地方和 PCR 進行的地方及 PCR 之后走膠的地方應(yīng)分開;

②所有試劑應(yīng)以最小量分裝以保證能恒定提供無污染的試劑;

③避免重復(fù)擴增(reamplification);

④貯存只用于 PCR 操作的吸量管、吸頭、試管,經(jīng)常用紫外線照射;

⑤連續(xù)進行 PCR 操作,應(yīng)嚴格按以下步驟進行;

⑥在樣品制備及 PCR 進行的全過程,應(yīng)戴手套操作;

⑦應(yīng)包括相應(yīng)的對照反應(yīng),內(nèi)對照、陽性對照、陰性對照及水溶液對照。

1. 用以下溶液對每個樣品進行二次測定

僅用于樣品:1 μl NTPs,1 μl Myco-5',1 μl Myco-3',1.5 μl 10× PCR 緩沖液,9.5 μl 蒸餾水。

用于樣品和內(nèi)對照 DNA:1 μl NTPs,1 μl Myco-5',1 μl Myco-3',1.5 μl 10× PCR 緩沖液,8.5 μl 蒸餾水,1 μl 內(nèi)對照 DNA,事先混合后貯存多份樣品,三個樣品用于無內(nèi)對照反應(yīng)(包括陽性、陰性及水溶液反應(yīng)),兩個樣品用于有內(nèi)對照反應(yīng),包括陽性、陰性對照,總體積要富余一些以彌補吸取過程的損失。

2. 將 14 μl 已混合好各種貯備液加入到 0.2 ml PCR 反應(yīng)管,加入 1 μl 蒸餾水用作水對照反應(yīng)。

3. 制備多聚酶混合液(每個反應(yīng) 10 μl,再加額外 10 μl,以保證吸取足夠量)。每個反應(yīng)中含有 1 份 PCR 緩沖液和 1 單位 Taq 多聚酶。

4. 移去所有用于制備事先混合貯備液的試劑。

5. 取出欲測試 DNA 樣品和陽性對照 DNA ,不要同時處理試劑和樣品。

6. 加 1 μl DNA 制備液至一個不包含內(nèi)對照 DNA 反應(yīng)管內(nèi),另加 1 μl DNA 制備液至一個包含內(nèi)對照 DNA 反應(yīng)管內(nèi)。

7. 進行熱啟動 PCR,將反應(yīng)混合物(未加多聚酶)轉(zhuǎn)移至加熱反應(yīng)器中,依照下面步驟進行一個加熱周期;

第一步:95°C,7 min;

第二步:72°C,3 min;

第三步:65°C,2 min;

第四步:72°C,5 min 。

在第二步時,打開加熱器蓋子,加入 10 μl 多聚酶混合液至每個管內(nèi),如有許多樣品則操作時間可能延長。打開或關(guān)閉反應(yīng)管應(yīng)分開進行,以避免樣品的揮發(fā)。在繼續(xù)進行下個周期步驟前,在加入 Taq 多聚酶至最后一個反應(yīng)管和關(guān)閉加熱器蓋前至少應(yīng)有 30 s 以平衡溫度以及移去蓋上冷凝物。

8. 在開始笫一個周期后,按照以下參數(shù)進行 32 個加熱周期:

笫一步:95°C,4 s;

笫二步:65°C,8S;

笫三步:72°C,16s;

每個周期再另外延 1 s 。

9. 72°C,10 min 完成最后的擴增步驟,結(jié)束反應(yīng),然后將樣品冷卻至室溫。

10. 制備一個含有 0.3 μl 溴化乙啶 /ml 的 1.3% 瓊脂糖-TAE 膠,膠上用 1×TAE (50× TAE(Tris 醋酸 EDTA): 2 mol/L Tris 基液,5.71% 冰醋酸(V / V),100 mmol/L EDTA,調(diào)節(jié) pH 至 8. 5)覆蓋,每孔加入 12 μl 擴增產(chǎn)物(10 μl 反應(yīng)混合物,2 μl 6× 加樣緩沖液(6× 加樣緩沖液:0.09% (W / V),溴酚藍,0.09% (W / V)二甲苯藍FF,60 % 甘油(V / V ),60 mmol/L EDTA)),10 V/cm 開始電泳。

11. 紫外線掃描顯示特異產(chǎn)物,記錄擴增結(jié)果。

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