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免疫熒光間接法測(cè)抗體法的原理和實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù):175 更新時(shí)間:2024-09-13

免疫熒光試驗(yàn)定義

一種免疫標(biāo)記技術(shù)。用于檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體。即用熒光素與抗體連接成熒光抗體,再與待檢標(biāo)本中的抗原反應(yīng),置熒光顯微鏡下觀察,抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光,借此對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行鑒定或定位。

⑴基本原理

染色程序分為兩步,第一步,用未知未標(biāo)記的抗體(待檢標(biāo)本)加到已知抗原標(biāo)本上,在濕盒中37℃保溫30min,使抗原抗體充分結(jié)合,然后洗滌,除去未結(jié)合的抗體。第二步,加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合,從而可鑒定未知抗體。

⑵試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋。

搪瓷桶三只(內(nèi)有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)

有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|)

熒光顯微鏡

玻片架

濾紙

37℃溫箱等。

⑶實(shí)驗(yàn)步驟

1)滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,10min后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。

2)滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。

3)取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過(guò)0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時(shí)振蕩。

4)取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。

5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。

6)重復(fù)操作3。

7)取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。

8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。

⑷注意事項(xiàng)

1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ,會(huì)使熒光減弱。

2)每次試驗(yàn)時(shí) ,需設(shè)置以下三種對(duì)照:

① 陽(yáng)性對(duì)照:陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物

② 陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物

③ 熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物

3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤(rùn),避免干燥。

4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色 。

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