單克隆抗體是利用體外培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的抗體,它由于是由一個細(xì)胞分裂而來的,所有只含有一種抗體。
單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)是:理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制,并且來源容易。這些優(yōu)點(diǎn)使其廣泛應(yīng)用于抗腫瘤等領(lǐng)域,缺點(diǎn)就是生成的抗體只針對1種抗原決定簇,比較單一。
基本過程:
1.抗原的處理
2.在小鼠體內(nèi)植入抗原(免疫)
3.取免疫鼠的B淋巴細(xì)胞
4.與鼠的骨髓瘤細(xì)胞用PEG細(xì)胞融合
5.在多孔板上篩選。雜交瘤細(xì)胞就是上面的34兩步
原理1:單克隆抗體(MAb)與抗血清(又稱多克隆抗體,PAb)最主要的區(qū)別是MAb為單一種B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細(xì)胞克隆的標(biāo)志,是一種du特型的抗體,它的特異性是針對一個抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學(xué)分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它,而是用分離產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞克隆的方法得到它。為了使B細(xì)胞克隆能在體外人工培養(yǎng)下長期存活并產(chǎn)生wan全均一的MAb,G.K?hler合Milstein于1975年創(chuàng)立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術(shù)又稱雜交瘤技術(shù)(hybredoma technique)。
雜交瘤技術(shù)的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養(yǎng)的B細(xì)胞與能在體外長期培養(yǎng)并可低溫保存的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交。篩選得到的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)該是既能分泌抗體又有瘤細(xì)胞的特性,可長期傳代培養(yǎng),又可在液氮中保存的細(xì)胞。把這些細(xì)胞單克隆化,用單克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)。
原理:最chang用的單克隆抗體是小鼠的單抗,此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復(fù)雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balb/c小鼠的B細(xì)胞和它的骨髓瘤細(xì)胞。大鼠的單抗制備通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤細(xì)胞。B細(xì)胞是從免疫動物的脾臟中分離出來的。動物免疫方法與抗血清制備相同,只是在制備脾臟前3d必須進(jìn)行一次靜脈加強(qiáng)注射以保證得到的B細(xì)胞有旺盛的分泌抗體的活性。骨髓瘤細(xì)胞有許多細(xì)胞株是經(jīng)過誘變和篩選得到的缺陷型。篩選的標(biāo)準(zhǔn)是①瘤細(xì)胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈,但不能分泌;②是次黃b呤鳥嘌y核苷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型。因?yàn)檫@種缺陷型的瘤細(xì)胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟(aminopterin)阻斷后,由于缺失這些酶,即使補(bǔ)充它的底物次黃嘌y(H)和胸腺嘧啶(T),核酸合成的旁路也不能起到救援的作用,結(jié)果導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡。而雜交瘤細(xì)胞因帶有B細(xì)胞的全套基因,在HAT存在的條件下借助于HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA。所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細(xì)胞只能存活3d而后自行死亡。這就是用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇的原理。