免疫熒光的原理

免疫熒光（Immunofluorescence,IF）原理免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。

細(xì)胞片制備（通俗的說(shuō)法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（SlidesorCoverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門(mén)，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響

細(xì)胞免疫熒光的詳細(xì)操作步驟

1，取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心。

2，4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3，0.2%Triton X 100通透10分鐘，PBS洗三遍。

4， 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5.，一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，PBS洗三遍。

6，二抗室溫2小時(shí)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。

7，最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。

8，蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。