HPLC法在研究中的應(yīng)用就是含量測定了，HPLC法應(yīng)用于含量測定時(shí)哪些需要注意的問題？外標(biāo)法含量計(jì)算方式有哪些注意事項(xiàng)是必知的？

除鑒別和有關(guān)物質(zhì)檢查外，HPLC法在化學(xué)藥物中的應(yīng)用就是含量測定了，另外在制劑的含量均勻度、溶出度、釋放度檢驗(yàn)項(xiàng)目中，HPLC法也發(fā)揮著越來越重要的作用，但其本質(zhì)與含量測定一樣，都是準(zhǔn)確定量的測定方法，因此，含量測定也包括含量均勻度、溶出度、釋放度等定量檢測項(xiàng)目。

1、HPLC法應(yīng)用于含量測定時(shí)需要注意的問題
在建立一個(gè)新的HPLC法含量測定方法時(shí)，方法建立以及方法學(xué)驗(yàn)證方案需要特別考慮下述多種因素對分析結(jié)果的影響。

（1）流動(dòng)相緩沖鹽的pH值
流動(dòng)相緩沖鹽的pH值對藥物的保留行為有影響，甚至?xí)@著改變某些堿性藥物的保留行為。當(dāng)流動(dòng)相中緩沖溶液的pH為3.0時(shí)，出峰順序?yàn)閘i多卡因、苯甲酰胺、酮洛fen，當(dāng)流動(dòng)相中緩沖溶液的pH為10.0時(shí)，三種藥物的出峰順序?yàn)橥錰en、苯甲酰胺、利多ka因二即使是梯度洗脫，流動(dòng)相中緩沖溶液的pH值仍然對藥物的保留行為產(chǎn)生影響。

(2)色譜柱
色譜柱的差異也會(huì)影響藥物的保留行為，即使是柱長、內(nèi)徑、粒徑相同的色譜柱，由于填料性質(zhì)的差異，藥物的保留時(shí)間、峰型有時(shí)會(huì)有較大差異。

(3)流動(dòng)相組成
以多元維生素制劑的含量測定為例，某制劑中含有4種維生素：煙酰an、維生素B6、維生素B2和維生素B1。如圖2所示，當(dāng)流動(dòng)相中己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉的相對比例由1:1變?yōu)?:6時(shí)，不僅各組分的保留時(shí)間、峰形有變化，甚至峰3、峰4沒有實(shí)現(xiàn)分離。

2、含量的計(jì)算方式
HPLC的定量方法可以分為內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。在儀器發(fā)展的初期，由于進(jìn)樣重復(fù)性差。為了保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確采用內(nèi)標(biāo)法較多。隨著自動(dòng)進(jìn)樣裝置的發(fā)展，進(jìn)樣的重復(fù)性已經(jīng)足夠精密，從90年代開始，大部分的內(nèi)標(biāo)法已經(jīng)被外標(biāo)法取代。

但是，在藥典制劑品種中還有一定數(shù)量的HPLC含量測定方法采用內(nèi)標(biāo)法。除了尚未修訂以外，以前擔(dān)心的進(jìn)樣重復(fù)性已經(jīng)不是采用內(nèi)標(biāo)法的原因，主要是因?yàn)樗幤分苿┖繙y定中樣品回收率或樣品制備方法的回收率影響，供試品溶液在萃取、離心處理或其他樣品溶液制備過程中不能保證樣品的wan全提取，以及輔料對低含量藥物的吸附作用，采用內(nèi)標(biāo)法可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。

3、外標(biāo)法含量計(jì)算方式注意事項(xiàng)
外標(biāo)法含量計(jì)算公式：含量=m對*P*A樣*V樣/（m樣*A對*V對）*100%

（1）樣品稱樣量
a、稱量方式采用的是加量法還是減量法，都是很有講究的。正常情況下，肯定要采用加量法，一次稱取到位，這樣才能得到準(zhǔn)確的稱樣量。

b、稱量操作稱量時(shí)，是否足夠小心，不會(huì)在轉(zhuǎn)移樣品時(shí)使樣品撒漏，這個(gè)是非常重要的。

c、樣品如果具有揮發(fā)性，直接稱樣時(shí)，必然會(huì)揮發(fā)一部分造成誤差；另外，如果樣品不穩(wěn)定，或在溶液中不穩(wěn)定，那么實(shí)際上來講，也是影響了樣品量。還有，樣品要保證均勻，固體不必說，液體樣品要保證是均相，稱量之前要搖勻。

（2）對照品含量
a、對照品質(zhì)量對照品是否有合法來源，其含量值是否準(zhǔn)確。

b、對照品的保存對照品是否按要求保存，也是至關(guān)重要的。因?yàn)槿绻麑φ掌窙]有按照規(guī)定保存，那么其右可能會(huì)發(fā)生降解，進(jìn)而影響含量值；另外，如果對照品是保存在冰箱中，稱量時(shí)，應(yīng)取出放在干燥器中回至室溫再稱量，否則其很有可能會(huì)吸收空氣中的水分，影響含量值。同理，如果對照品引濕性很強(qiáng)的話，長期暴露在空氣中，也會(huì)使其P發(fā)生變化。

（3）樣品峰面積
a、如果所用的分析方法可靠性不好，樣品峰面積或保留時(shí)間容易變化，那么檢測結(jié)果也是很重現(xiàn)性不好的。

b、如果儀器系統(tǒng)被污染產(chǎn)生殘留，而本身峰面積就不大的情況下，這個(gè)因素產(chǎn)生的誤差就更明顯了。

c、如果樣品峰形不夠好，或者分離度不夠好的情況下，積分就很重要。

（4）樣品的稀釋體積
a、容量瓶、移液管等體積是否準(zhǔn)確。一般來說，新買的容量瓶體積是符合要求的，但是也難免會(huì)買到個(gè)別次品，這就需要進(jìn)行校驗(yàn)了。

b、容量瓶、移液管規(guī)格。這個(gè)是很重要的，一般大家都能注意這個(gè)問題，做到合理使用。

c、試驗(yàn)習(xí)慣問題，容量瓶在使用時(shí)，不能使其至于高于40攝氏度的環(huán)境下，否則容量瓶會(huì)發(fā)生變形。

d、定量操作，這個(gè)包括容量瓶和移液管的使用，注意事項(xiàng)：
一是移液管吸液時(shí)，液面不要高刻度太多，放液時(shí)千萬不要用洗耳球吹，并且盡量保持每次操作時(shí)間都一樣，粘度大的溶液尤其需要如此。
二是觀察液面時(shí)，要使容量瓶和移液管保持垂直，這時(shí)很多人喜歡用三根手指捏住，其實(shí)這樣不容易保持垂直，最好用兩根手指，輕輕捏住就好。
三是注意接觸容量瓶移液管等的面積越小越好，以免體溫加熱溶液。

e、如果對照品和樣品沒有用同一份稀釋劑稀釋的話，兩者就會(huì)有差異，受到溫度變化的影響也是不一樣的。比如，所用的稀釋劑為水：甲醇=50：50，對照溶液用的是上次配好的，然后樣品用的是新配的，因?yàn)樗图状蓟旌蠒?huì)放熱，其體積也會(huì)增大，等到進(jìn)樣時(shí)，樣品溶液回至室溫，體積減小，就會(huì)造成檢測結(jié)果偏高。

f、如果前后室溫變化的話，也會(huì)造成分析結(jié)果的誤差。比如，對照溶液進(jìn)樣時(shí)，是正常上班時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室開了空調(diào)，溫度為20℃，而到樣品溶液進(jìn)樣時(shí)，已經(jīng)到下班時(shí)間了，實(shí)驗(yàn)室人員下班時(shí)將空調(diào)關(guān)閉，實(shí)驗(yàn)室溫度已經(jīng)降為10℃，這時(shí)樣品溶液濃度肯定也會(huì)增大。

g、由于對照品相對比較貴重，一般實(shí)驗(yàn)室都會(huì)保存一段時(shí)間。如果下次分析時(shí)沒有回至室溫，或此時(shí)室溫與對照品溶液配制時(shí)的溫度已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化，都會(huì)造成分析結(jié)果的誤差。

h、有些人配好樣品后，喜歡用手去握著容量瓶，細(xì)心觀察的就會(huì)發(fā)現(xiàn)一會(huì)之后液面就明顯高于刻度。如果操作者沒有注意這點(diǎn)，有的樣品立即進(jìn)樣，有的排隊(duì)過了一會(huì)再進(jìn)樣，就會(huì)造成誤差。