蛋白表達問題一直備受關(guān)注，如何實現(xiàn)蛋白高效表達這個老生常談的話題，今天遠慕來探討一下。

影響蛋白表達的因素主要有：

1.載體構(gòu)建錯誤
這個是很多克隆新人常犯的錯誤，在克隆時弄錯讀碼框，從而導致蛋白不表達。蛋白表達載體構(gòu)建正確是蛋白表達實驗的基礎(chǔ)，構(gòu)建載體時要考慮啟動子、多克隆位點、終止子、融合標簽、復(fù)制子等多種因素。

2.宿主菌選擇不當
不同宿主菌的基因型不同，選擇合適的宿主菌對某些特殊的載體進行蛋白表達至關(guān)重要。有時表達重組的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，會造成質(zhì)粒丟失。

3.GC含量
不同物種間基因組的GC含量有顯著差異，GC含量通常間接對基因表達進行調(diào)控和影響，超過70%可能會減低蛋白表達水平。

4.密碼子優(yōu)化

（1）密碼子偏愛性
不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛性，甚至同物種內(nèi)不同功能的基因其密碼子使用頻率也存在較大的差異，密碼子偏愛性對重組蛋白的表達具有深刻復(fù)雜的影響。
密碼子的偏愛性是通過控制可用tRNA豐度影響蛋白的翻譯過程，tRNA的缺乏可能導致對應(yīng)的稀有密碼子在蛋白表達過程中使翻譯速率降低甚至終止，從而使蛋白水平顯著降低。

（2）密碼子的使用頻率低。
某些基因本身含稀有密碼子，擁有所用宿主的稀有密碼子越多的基因，越難在該宿主中表達出理想水平的重組蛋白?？蛇x用高頻使用的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子，或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎(chǔ)上進行重新合成，同時使密碼子組成頻率更接近宿主。
但是研究表明，密碼子的優(yōu)化必須與蛋白的高級結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，如果通過一味地替換稀有密碼子來提高重組蛋白的表達可能會起到適得其反的結(jié)果。

5.mRNA二級結(jié)構(gòu)

mRNA如果形成大而穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，尤其是起始密碼子附近的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，將會影響mRNA在翻譯過程中核糖體的結(jié)合和延伸，從而降低翻譯的效率和最終的蛋白表達水平。
如果序列里有和核糖體結(jié)合位點/或翻譯起始位點互補的序列，由此形成的mRNA二級結(jié)構(gòu)，會讓翻譯嘎然而止，此時就需要進行同義密碼子替換。
因此，合理優(yōu)化翻譯起始區(qū)的mRNA二級結(jié)構(gòu)，將有效提高目的蛋白表達水平。

6.mRNA的穩(wěn)定性

蛋白的表達調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，一般來說，轉(zhuǎn)錄水平起關(guān)鍵作用，但同時翻譯的效率與mRNA的降解直接相關(guān)，因此，也間接影響著轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。原核表達中，存在稀有密碼子的mRNA翻譯過程受到影響，使得mRNA得不到更多核糖體結(jié)合后的有效保護，也將導致mRNA的降解從而使蛋白積累水平顯著降低。

7.基因突變

堿基的缺失、插入或突變，都會對翻譯的蛋白產(chǎn)生影響，在PCR擴增時，堿基序列突變?yōu)榻K止密碼子，會導致蛋白翻譯意外終止。所以在進行表達之前，通常要進行測序來避免這種情況的發(fā)生。

當然，影響蛋白表達的其他要素或優(yōu)化方法，還包括檢查單核苷酸重復(fù)和密碼子重復(fù)，起始密碼子環(huán)境，終止密碼子及其環(huán)境，避免內(nèi)含子、AT 富含區(qū)、內(nèi)部核糖體進入位點 (IRES)、重組位點等不利元件，選擇合適的 UTR 序列和信號肽序列，合理設(shè)計酶切位點、接頭、融合基因、檢測和純化標簽等。其他影響蛋白表達因素，歡迎小伙伴們補充。