在做慢病毒包裝實驗中，大家是不是經(jīng)常遇到：用同樣的病毒載體系統(tǒng)進行實驗，為什么有人做的很好，次次成功，有人卻是時常做不出來，穩(wěn)定性很差，不是滴度低就是根本不出毒？

今天遠慕生物就把10年的病毒包裝經(jīng)驗總結(jié)給大家，首先我們來簡要介紹下慢病毒包裝的流程：

影響慢病毒包裝是否成功的因素有很多，例如：細胞狀態(tài)、質(zhì)粒比例、質(zhì)粒抽提純化情況、轉(zhuǎn)染試劑和條件、目的基因本身的影響等等。我們詳細列出了如下幾點。

1.實驗材料的選擇

我們進行慢病毒包裝時要重視實驗材料——建議使用商品化的成熟毒載體系統(tǒng)，遠慕生物慢病毒包裝三質(zhì)粒系統(tǒng)為：psPAX2, pMD2.G 及 pHBLV系列質(zhì)粒。包裝細胞293T細胞培養(yǎng)時要讓它“白白胖胖、活力充沛"。并且要定期純化包裝細胞、檢測表達質(zhì)粒。

2、目的基因?qū)β《景b的影響

目的基因的大小、序列情況、目的蛋白的功能毒性等都有可能導(dǎo)致包裝失敗。一般慢病毒包裝的目的片段大小在2.5k以內(nèi)較為合適，大于2.5k會降低滴度或超過載體容量無法包裝。并且，可能存在一些基因表達翻譯后對包裝細胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細胞狀態(tài)異常，無法完成病毒包裝，這種情況我們可以嘗試更換病毒包裝系統(tǒng)，例如選擇包裝腺病毒。

3、載體構(gòu)建和抽提純化環(huán)節(jié)

載體構(gòu)建時我們需要注意是否存在以下情況：質(zhì)粒載體重組、某個部件缺失、污染別的質(zhì)?；螂s物、中抽純化污染等。要養(yǎng)成同時做陰性對照的習(xí)慣：目的基因載體和陰性對照GFP 載體是同一批，且每次包裝都如此操作。要保證目的基因的表達載體構(gòu)建純化良好，質(zhì)粒間比例得當(dāng)，建議三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時的摩爾比為1：1：1。

4、細胞轉(zhuǎn)染及病毒收集階段

細胞出毒期間過程中的細胞活力是包裝成功及病毒滴度高低的一個重要環(huán)節(jié)，進行包裝轉(zhuǎn)染293T細胞前一定要重視細胞是否干凈、飽滿立體感是否好、鋪板是否均勻，細胞密度在50-60%時進行包裝比較合適。在24、48 小時的要觀察細胞及熒光狀態(tài)，判斷是否正常，轉(zhuǎn)染后48h和72h分別兩次收集病毒上清(48h收集后置換新鮮培液)。

當(dāng)然，最重要的是，在進行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞時，使用遠慕生物慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑：LentiFit。效率高、毒性低，血清的存在不影響轉(zhuǎn)染效率，讓你的細胞在包裝慢病毒時“又圓又胖"，大大提高了慢病毒包裝的成功率。