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PCR實驗最常見的9個問題及解決方案
點擊次數(shù):404 更新時間:2022-11-25

1. 如何有效設(shè)計引物
(1)使用Oligo或Primer設(shè)計引物,在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計,長度一般在18-27bp,上下游引物Tm值最好是60-75℃,GC含量=40%-60%,引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列,避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2. PCR電泳無擴增條帶
(1)酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不當(dāng)而失活,往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。
(2)模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
(3)變性溫度是否準(zhǔn)確:PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活;過低則模板變性不徹/底。
(4)反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,應(yīng)在未加Taq酶以前,將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。
(5)引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化,或因儲存條件不當(dāng)而失活。
(6)引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
(7)DNA凝膠電泳時加入陽性對照,確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

3. PCR產(chǎn)物量過少
(1)退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
(2)DNA模板量太少。增加DNA模板量。
(3)PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。
(4)引物量不足。增加體系中引物含量。
(5)延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時間。
(6)變性時間過長。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活。
(7)DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈

4. 擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
(1)酶量過高。減少酶量;酶的質(zhì)量差,調(diào)換另一來源的酶。
(2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
(3)MgCl2濃度過高。可適當(dāng)降低其用量。
(4)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
(5)引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
(6)循環(huán)次數(shù)過多;增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
(7)退火溫度過低。
(8)電泳體系有問題:
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;
②凝膠沒有凝固好;
③瓊脂糖質(zhì)量差。
(9)若為PCR試劑盒則可能:
①由于運輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效;
②試劑盒本身質(zhì)量有問題,如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。
(10)降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布。

5. 擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)
(1)引物用量偏大,引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
(2)循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量,減少循環(huán)次數(shù)。
(3)酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好,應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
(4)退火溫度偏低,退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度,減少變性與延伸時間,也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
(5)樣品處理不當(dāng)。
(6)Mg2+濃度偏高,因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
(7)若為PCR試劑盒,也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。
(8)復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。
(9)反應(yīng)緩沖液未完/全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完/全并徹/底混勻。
(10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
(11)引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
(12)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
(13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。

6. 陰性對照出現(xiàn)條帶
(1)試劑,槍頭,工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭,對工作臺進行清潔。

7. 條帶大小與理論不符
(1)污染。使用全新的試劑和槍頭,對工作臺進行清潔。
(2)模板或引物使用錯誤。查看引物是否會擴增部分條帶和模板是否正確。
3)基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。

8. 持續(xù)出現(xiàn)假性條帶
(1)起始退火溫度太低,或目的擴增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的T值相差不大??蓢L試適當(dāng)提高PCR溫度或者設(shè)置降落PCR,降低循環(huán)數(shù)。

9. 菌落PCR檢測有條帶,接種大搖后無條帶
(1)可重新以菌落和菌液為模板進行PCR對照檢測,因為菌落PCR的假陽性概率還是比較高。如果仍出現(xiàn)上述結(jié)果,推測可能是平板上連接液中的未連接載體的擴增引起的目的條帶,進一步質(zhì)粒PCR檢測,可證明目的片段是否真正連接成功。

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