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上海遠慕生物科技有限公司

遠慕技術:蛋白的生物活性測定方法
點擊次數(shù):426 更新時間:2022-10-08

結晶紫法活性測定
1、取對數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細胞,用0.25%胰/酶(以無鈣鎂離子PBS溶液配制,pH7.4)消化后,加入RPMI-1640培養(yǎng)基(10%新生牛血清,100U/ml青霉/素,100U/ml鏈霉/素,pH7.2)吹打細胞,使形成細胞懸液。進行細胞計數(shù),使細胞數(shù)為2~2.5x105個/ml。接種于96孔細胞培養(yǎng)板,100µl/孔。接種細胞時須不斷搖動細胞懸液,以保證各孔細胞數(shù)的均勻一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h,觀察到孔中細胞長滿70~80%。
2、在上述RPMI-1640*培養(yǎng)基中加入放線/菌素D,使終濃度為1.5µg/ml,配成樣品稀釋液。取此稀釋液900µl至Eppendorf管中,另在9個5ml管中加入700µl稀釋液。
3、用*培養(yǎng)基將基因工程人腫瘤凋亡素樣品(上海恰爾生物技術有限公司研制,批號:0304,凍干粉劑,蛋白濃度:2mg/支)復溶至1000µl(液體樣品測定蛋白濃度后,直接進行下一步操作),取出100µl至已裝有900µl稀釋液的Eppendorf管中,充分混勻,盡量不起泡沫。再從此管中吸出100µl至下一管中,如此反復n次(即測定前/10倍稀釋若干次,直到與估計活性相接近時)。
4、從最后稀釋的Eppendorf管中吸出700µl樣品至已裝有700µl稀釋液的5ml管中,充分混勻。再從此管中吸出700µl至下一管同樣裝有700µl稀釋液的5ml管中,如此反復9次(即測定時倍比稀釋樣品)。
5、棄去96孔板中舊的培養(yǎng)基,從第一個5ml管中吸取已稀釋的樣品100µl至第2排細胞孔中,每個稀釋度作6復孔(n=6);從第二個5ml管中吸取的樣品加入第3排細胞中,依此類推,直至第10排孔結束。第1排中不含細胞,加入100µl/孔含有放線菌/素D的稀釋液作空白對照;第11排加100µl/孔稀釋液作細胞對照;第12排加不含放線/菌素D的RPMI-1640*培養(yǎng)基。
6、將加好樣品的96孔板置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)22h,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,初步判斷結果。
7、棄除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,每孔加入100µl染色液(1.5mmol/L結晶紫)染色30min。洗去染色液,甩去水分并在吸水紙上拍打以使干燥。沖洗程度以在吸水紙上拍打時,沒有顏色出現(xiàn)為宜。
8、充分干燥后,每孔加入100µl33%濃度的冰醋酸,在振蕩儀上充分振蕩使結晶溶解。設定λ=595nm酶聯(lián)檢測儀測定各孔的吸光值,據(jù)此數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,計算出對細胞50%殺傷時所需的基因工程人腫瘤凋亡素的濃度。

[活性計算]
活性單位定義:在上述測定條件下,以50%SW1990腫瘤細胞被殺傷時,為基因工程人腫瘤凋亡素的1個活性單位。
1、樣品的稀釋度取常用對數(shù)。
2、根據(jù)對應的細胞毒活性(光密度值)與稀釋度的對數(shù),進行線性回歸,得到計算公式y(tǒng)=ax+b,分析相關系數(shù)R值,符合統(tǒng)計學要求者進行下一步分析。
3、代入50%殺傷時的光密度值(即第11排細胞光密度值的一半),計算出稀釋倍數(shù)的對數(shù),再求出稀釋倍數(shù)。
4、根據(jù)原樣品濃度及稀釋倍數(shù)計算出基因工程人腫瘤凋亡素對細胞50%殺傷時的濃度,再算出比活性。
5、其他細胞的檢測方法同上,計算時根據(jù)對SW1990標定的基因工程人腫瘤凋亡素活性單位,先求出對細胞50%殺傷時的所需活性單位,再根據(jù)基因工程人腫瘤凋亡素對SW1990細胞殺傷的比活性算出相應的絕對量。

[計算結果]
0304批原液:比活為:1.03×107活性單位/mg

蛋白的生物活性及結構測定方法
生物活性測定[37,38]是將人胰腺癌1990細胞以2×105個/ml種入96孔細胞培養(yǎng)板,37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6小時,用*培養(yǎng)液(加有1.2µg/m的放線/菌素D)做梯度稀釋的樣品加入細胞板(n=3)。置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱,18h后棄上清,以結晶紫固定液(結晶紫0.5%,甲醛8%,NaCl0.1%,乙醇20%)染色15min,蒸餾水洗去結晶紫。每孔再加入200μ33%的乙酸,旋渦混勻,置酶聯(lián)儀讀出D(595)值,以未加細胞的空白孔為D本底。根據(jù)活性單位定義:使培養(yǎng)孔中的細胞50%死亡為一個單位。

MTT法——活性測定
1、 接種細胞:用0.25%胰蛋/白酶消化單層培養(yǎng)細胞,用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,以每孔103-104 個細胞接種于96孔板中,每孔體積200μl。
2、 培養(yǎng)細胞:將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中,在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下,培養(yǎng)3-5天。(培養(yǎng)時間取決于實驗目的和要求)
3、 呈色:培養(yǎng)第3-5天后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μl,37℃,繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內培養(yǎng)液上清。每孔加入150μlDMSO(二甲基亞砜),振蕩10min,使結晶物充分溶解。
4、 比色:選擇490nm波長,在酶標儀上測定個孔吸收值,記錄結果。

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