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IgG的分離與提純實驗
點擊次數(shù):495 更新時間:2022-08-04

  實驗方法原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離,是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子,從而破壞蛋白質表面的水化膜,降低其溶解度,使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同,因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大,溫度系數(shù)小和不易使蛋白質變性而應用最/廣。

實驗材料 動物血清樣品

試劑、試劑盒 硫酸銨NH4OHPB液BaCl2溶液納氏液洗脫液生理鹽水

儀器、耗材 透析袋離心機燒杯攪拌棒

實驗步驟

一、材料與試劑配制

1.  動物血清

2.  硫酸銨飽和溶液

硫酸銨:800 g~850 g

H2O :1 000 ml

加熱至絕大部分溶質溶解為止,趁熱過濾,置室溫過夜,然后以28% NH4OH調pH至7.0(不調pH值也可以)。

注:硫酸銨以質量優(yōu)者為佳,因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬,可在溶液中通入H2S,靜置過夜后濾過,加熱蒸發(fā)H2S即可。

3.  0.01 mol/L pH7.4 PB液

A液:0.10 mol/L NaH2PO4液

NaH2PO4·2H2O :15.60 g

加H2O至1 000 ml

B液:0.10Mol/L Na2HPO4液

Na2HPO4·12H2O: 35.80 g

加H2O至1 000 ml

取A液19 ml,B液81 ml加水至1 000 ml即可。

4.  1%BaCl2溶液

5.  納氏液

HgI :115.00 g

KI: 80.00g

加H2O至500.00 ml

溶化后過濾,然后再加20%NaOH 500.00 ml,混合即可。

6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液

7、洗脫液

0.03 mol/L的NaCl液。

8、透析袋(或玻璃紙)

二、操作方法

1.  取20 ml血清,加生理鹽水20 ml,再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10 ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,邊加邊攪拌,充分混合后,靜置30 min。

2.  3 000 r/min離心20 min,棄去沉淀,以除去纖維蛋白。

3.  在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30 ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,靜置30 min。

4.  3 000 r/min離心20 min,棄上清。

5.  于沉淀中加20 ml生理鹽水,使之溶解,再加(NH4)2SO4飽和溶液10 ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,靜置30 min。

6.  3 000 r/min離心20 min,棄上清,以除去白蛋白。重復步驟5,2~3次。

7.  用10 ml生理鹽水溶解沉淀,裝入透析袋。

8.  透析除鹽,在常水中透析過夜,再在生理鹽水中于4℃透析24 h,中間換液數(shù)次。

以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 (取3~4 ml透析液,加試劑1~2滴,出現(xiàn)磚紅色即認為有NH4 存在),直至無SO42-或NH4 出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。

9.  離心去沉淀(去除雜蛋白),上清液即為粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優(yōu)球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。

10.  過DEAE-纖維素層析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS(0.03 mol/L NaCl)洗脫,收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。

11.  蛋白質及其定量鑒定。

12.  IgG的純度鑒定可采用下列方法之一鑒定。

(1)區(qū)帶電泳

玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后,只在γ—球蛋白的遷移部位出現(xiàn)一條帶。操作時,同時可用全血清樣品,不同濃度(NH4)2SO4鹽析樣品進行電泳,以資比較。

(2)瓊脂雙相雙擴散鑒定

預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散,如IgG提純的話,則在兩樣品孔之間出現(xiàn)一條沉淀線。

(3)免疫電泳鑒定

孔內加待測樣品,電泳后,在槽內加抗IgG血清,瓊脂擴散24h,觀察結果。如果提取的IgG純的話,則只出現(xiàn)一條弧形的沉淀線,且沉淀線位于γ—球蛋白區(qū)。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳,以資比較。

(4)圓盤電泳鑒定

用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現(xiàn)數(shù)十條區(qū)帶,而純化的IgG則只有一條區(qū)帶。

13.  IgG的濃縮與保存

(1)IgG的濃縮

(2)IgG的保存

一般濃縮至1%以上的濃度,再分裝成小瓶凍干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存,注意防止反復凍融。

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