1.  為什么免疫后沒有效價(jià)或免疫后效價(jià)低？

答：可以從這幾個(gè)方面一一考慮：

（1）設(shè)計(jì)的抗原與被免疫的動(dòng)物內(nèi)源蛋白有*的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對(duì)于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計(jì)抗原，設(shè)計(jì)抗原時(shí)盡量選取目標(biāo)蛋白特異性的序列，可以設(shè)計(jì)為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對(duì)于后一種情況，首先確認(rèn)小分子物質(zhì)是否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián)，如果偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。

（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長(zhǎng)或過短，各免疫步驟之間的間隔過長(zhǎng)或過短都有可能影響免疫效果，詳細(xì)請(qǐng)參考本站有關(guān)動(dòng)物免疫的部份，實(shí)際操作中的相關(guān)程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時(shí)，對(duì)于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證*有效，此時(shí)可以考慮更換佐劑嘗試。

（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。一般來說，實(shí)際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

（5）免疫途徑不合理。對(duì)于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內(nèi)免疫方法，具體操作本站上也有詳細(xì)的講解。

（6）測(cè)效價(jià)的過程存在錯(cuò)誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時(shí)，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對(duì)于小分子物質(zhì)，效價(jià)達(dá)到1：2000仍可視為免疫成功。

2.  為什么融合后細(xì)胞不長(zhǎng)或者融合后克隆很少？

答：可以從這幾個(gè)方面考慮：

（1）免疫用的動(dòng)物品系不正確或者品系不純。免疫用的動(dòng)物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動(dòng)物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時(shí)必須使用品系純正的小鼠。

（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。

（4）未正確制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。參見本站有關(guān)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備的部份。

（5）接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

（6）融合后，未及時(shí)轉(zhuǎn)移或稀釋細(xì)胞。有人在做融合后喜歡把融合的細(xì)胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時(shí)間過長(zhǎng)，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。

（7）細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測(cè)。

（8）細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確，確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時(shí)保證CO2濃度在4-5%左右。

（9）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩亍Ｔ斠姳菊居嘘P(guān)細(xì)胞融合的部份。

3.  為什么融合后得不到陽性克隆？

答：可能的原因：

（1）動(dòng)物未免疫成功就進(jìn)行了融合。具體解決方法參照本頁(yè)面第1個(gè)問題。

（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機(jī)率也較小。具體解決方法，請(qǐng)參照本頁(yè)面第2個(gè)問題。

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上，再如使用了不適當(dāng)?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份與細(xì)胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結(jié)構(gòu)相同或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合，最后做ELISA篩選的時(shí)候無法得到陽性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動(dòng)物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時(shí)，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

（5）其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關(guān)ELISA實(shí)驗(yàn)的講解與討論。

4.  為什么我的細(xì)胞生長(zhǎng)很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知/名廠商的試劑或耗材。對(duì)于血清，可能需要從多個(gè)廠家選用多個(gè)批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在試用血清的時(shí)候，一般可以使用相對(duì)較低濃度的血清進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。

（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確。

（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁(yè)面第二個(gè)問題。

（4）其它問題，可以參考本頁(yè)面第二個(gè)問題。

5.  我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？

答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對(duì)穩(wěn)定的，確實(shí)容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長(zhǎng)，如從小孔擴(kuò)大到大孔，或者復(fù)蘇操作時(shí)，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮?。但是也有一些辦法盡量減少陽性變?yōu)殛幮缘霓k法。一般可以從這幾個(gè)方面加以注意：

（1）永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最佳的生長(zhǎng)環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長(zhǎng)期不換，一般來說，當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)到一定密度的時(shí)候，培養(yǎng)基就開始變顏色，這個(gè)時(shí)候就要準(zhǔn)備換培養(yǎng)基了，除了換培養(yǎng)基，同時(shí)應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度，可以吹走過多的細(xì)胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。

（2）對(duì)于重要的細(xì)胞株，每一步都把陽性的細(xì)胞保種。

（3）不要過于頻繁操作細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度不是很大的時(shí)候，不要頻繁操作，否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生明顯變化。

（4）對(duì)于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需要經(jīng)常進(jìn)行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

（5）當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染，也會(huì)發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。

6.  為什么我做亞克隆后長(zhǎng)不出克隆來？

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長(zhǎng)的原因類似，但是除此之外，也還有一些*的原因。

（1）亞克隆時(shí)，原始孔里的細(xì)胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差，以至于長(zhǎng)不出克隆。

（2)亞克隆時(shí)，沒有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞，在本站有關(guān)亞克隆操作的頁(yè)面上提到過，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個(gè)細(xì)胞，或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個(gè)細(xì)胞，則也可能出現(xiàn)長(zhǎng)不出克隆的結(jié)果。

（3）未添加飼養(yǎng)層細(xì)胞。單個(gè)細(xì)胞在*培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)層細(xì)胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長(zhǎng)不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對(duì)雜交瘤的生長(zhǎng)并不是必須的，但是HT確實(shí)可以加快細(xì)胞生長(zhǎng)，改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

（5）使用無血清培養(yǎng)基。這一點(diǎn)是很冷僻的一個(gè)因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，可能會(huì)選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養(yǎng)基中，單個(gè)細(xì)胞是很難長(zhǎng)成克隆的。最/好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長(zhǎng)出后再把培養(yǎng)基*更換為無血清培養(yǎng)基。

7.  為什么我凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？ 

答：這個(gè)問題要從兩個(gè)方面來回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。 對(duì)于凍存過程，需要注意：

（1）凍存液的配方。這個(gè)問題很關(guān)鍵，一個(gè)良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好，而一個(gè)不好的凍存液配方可能會(huì)讓細(xì)胞傾刻死亡。目前認(rèn)為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，不管是哪一種，凍存保護(hù)劑DMSO的含量非常重要，如果這個(gè)濃度過低，則起不到保護(hù)作用，凍存的細(xì)胞最終會(huì)死于冰晶形成時(shí)的張力，如果濃度過高，則細(xì)胞中毒而亡。如果使用第二個(gè)配方，注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，而盡量不要用一般的*培養(yǎng)基，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻(xiàn)中也有提到用甘油作為凍存保護(hù)劑的，站長(zhǎng)自己沒有親自試過，不發(fā)表評(píng)論。如果新手確實(shí)對(duì)這個(gè)沒把握，市場(chǎng)上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細(xì)胞的時(shí)候更是要輕柔，因?yàn)樵贒MSO存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機(jī)會(huì)就明顯會(huì)下降。

（3）凍存的程序也非常重要。實(shí)踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細(xì)胞是最/理想的。如果條件簡(jiǎn)易，可以把細(xì)胞放在4 ℃半小時(shí)左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-80 ℃放置過夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行?，F(xiàn)在市場(chǎng)上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細(xì)胞放進(jìn)去，然后直接放-80 ℃就行，等時(shí)間夠長(zhǎng)后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。

（4）細(xì)胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進(jìn)入凍存管。這一點(diǎn)很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實(shí)這是錯(cuò)誤的。有人認(rèn)為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機(jī)會(huì)進(jìn)入凍存管，最終可能造成細(xì)胞污染。

（5）保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，并且沒有被污染。 

對(duì)于復(fù)蘇過程，需要注意：

（1）快速。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強(qiáng)烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復(fù)蘇，并不斷晃動(dòng)凍存管。

（2）復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。

（3）有的人復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對(duì)細(xì)胞造成毒害，因此強(qiáng)烈建議將融化的細(xì)胞離心后去掉凍存液，然后用新的*培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。

8.  為什么我的細(xì)胞總是污染？如何可以救活污染的細(xì)胞？

答：養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)污染，幾乎是每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)員容易出現(xiàn)的問題。要防止細(xì)胞污染，無非就是保證培養(yǎng)環(huán)境無污染，保證所用的所有試劑都無污染源，同時(shí)提高操作時(shí)的警惕性，這些基本的知識(shí)這里就不再?gòu)U話了。