養(yǎng)細(xì)胞真的是磨練人性格的一項(xiàng)工作。細(xì)菌真菌支原體各種污染都經(jīng)歷過了，能把癌癥細(xì)胞養(yǎng)到絕種也是很無奈。
生活的閱歷就是最大的智慧，所以今天跟大家匯總了細(xì)胞間常用的無菌技術(shù)操作指南如下:
1、我們要挑選了一個平時很少有人用的實(shí)驗(yàn)室作為無菌室，超凈臺不能放在靠近門口和窗戶的位置，這個區(qū)域要保持干凈無灰塵。為保證超凈臺工作面的無菌，使用前需用75%的乙醇擦拭工作面。
2、每天實(shí)驗(yàn)開始時候，超凈臺/實(shí)驗(yàn)間 照20分鐘紫外是不錯的選擇。拿培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)液時候請托下面拿，切忌不要拿瓶頸部位。
3、工作前和工作后，都要對超凈臺進(jìn)行擦拭，特別是有液體溢出的地方。各種盛裝液體的瓶子從冰箱內(nèi)拿出來后，都要用75%乙醇進(jìn)行擦拭。為確保無菌操作，最好每次使用之前也要再進(jìn)行擦拭。
4、在操作過程中，超凈臺上的所有物品需擺放整齊。整齊的原則是：需要的東西要很容易拿到，拿東西的時候不能跨越其他物體；超凈臺內(nèi)的物品不宜過多，否則會影響無菌空氣的層流；實(shí)驗(yàn)完畢后擦拭整個超凈臺面，并移走所有物品。
5、對于我們從試劑公司購買的培養(yǎng)基、血清或者其他試劑，一定是經(jīng)過廠家的質(zhì)量監(jiān)控保證無菌的，但是盛裝試劑的瓶子外表不是無菌的。所以在實(shí)際操作中，要在超凈臺下拆下外包裝，每次使用前需用75%乙醇擦拭。（在這里提出一點(diǎn)疑問，有很多人說培養(yǎng)基和血清不能照紫外，也有人說二者是可以照紫外的，希望有大神幫忙回答一下）
6、從其他實(shí)驗(yàn)室借來的細(xì)胞，因?yàn)闊o法保證原來的實(shí)驗(yàn)室或運(yùn)輸途中是否有污染情況出現(xiàn)，所以首先要在沒有抗生素的情況下，和本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞分開培養(yǎng)一段時間，直到證明它們沒有被污染再放到同一空間。
7、如果不是大批量培養(yǎng)細(xì)胞，我們會用廣口瓶配制盛裝培養(yǎng)基。廣口瓶*的深螺旋蓋子防污染的效果很好，但是清洗的時候要特別注意，以防瓶蓋內(nèi)殘留的液體沒有清洗干凈。
8、培養(yǎng)皿的敞口時間不易過長，不要在敞口的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿的上方操作。當(dāng)把培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱拿出或放入培養(yǎng)箱中時，小心不使它們傾斜或受到搖晃，避免培養(yǎng)基進(jìn)入蓋子和皿身的夾縫中。如果不小心出現(xiàn)上述情況，應(yīng)用75 % 乙醇擦掉溢出的培養(yǎng)基，并更換新的蓋子。
9、雖然我們在操作的過程中會帶無菌手套，穿無菌服，但是個人衛(wèi)生也是很重要的一點(diǎn)。手部的清潔可以濕潤皮膚，洗掉一些微生物，帶走某些皮膚干屑。如果女生是長頭發(fā)，也要盤頭或馬尾系在身后。如果患有感冒，最好在感冒好之前不要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)工作，即使帶上口罩，也不能阻擋感冒病毒。
10、玻璃吸管或塑料吸管是轉(zhuǎn)移液體最/方便的途徑。滅菌前，要在玻璃吸管的吸口端加一個棉塞，這個塞子能起到防止液體回流造成交叉污染的作用。
11、污染可以從一個小范圍或一個培養(yǎng)皿擴(kuò)散到幾個培養(yǎng)皿，乃至整個培養(yǎng)箱中。觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞狀態(tài)的時候，一定要肉眼和顯微鏡雙重仔細(xì)觀察；不能與其他實(shí)驗(yàn)人員公用同一個瓶子，不同種類的細(xì)胞系哪怕培養(yǎng)基相同，也不能使用同一個瓶子。
12、在操作過程中，打開和關(guān)上瓶蓋的前后都需要在酒精燈火焰旁灼燒瓶口和瓶蓋。由于空氣對流的原因，在火焰旁操作，火焰旁的空氣向上走，可以減少附近區(qū)域灰塵下降。
13、超凈臺之所以會營造出一個無菌的環(huán)境，是因?yàn)槔锩嬗谐掷m(xù)穩(wěn)定的過濾氣流通過超凈臺面。水平式超凈臺的氣流是從實(shí)驗(yàn)人員的對面吹出，與臺面平行。垂直式超凈臺的氣流是從頂部向下吹的臺面，被吸入后循環(huán)利用。所以對于垂直式超凈臺的實(shí)驗(yàn)人員來說，操作時不要在開口的上方操作；而對于水平式的超凈臺，實(shí)驗(yàn)人員盡量不要在開口的后方操作。
14、水平式超凈臺可以提供相對穩(wěn)定的氣流，對培養(yǎng)物和試劑的無菌保護(hù)作用較強(qiáng)。但是垂直式給予實(shí)驗(yàn)人員的保護(hù)更多。
15、在操作過程中，不要把液體從一個瓶子倒入另一個瓶子中，因?yàn)檫@種傾倒方式會將讓液體變成連接瓶內(nèi)外空氣的橋梁。即使瓶子是無菌容器，這種方式也會增加污染的風(fēng)險(xiǎn)。
16、水浴鍋很臟，生化培養(yǎng)箱要是得手動加濕的話盤里的水也會很臟，勤換 (滅菌水加進(jìn)去)。
17、操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
18、離開過操作臺的東西再進(jìn)操作臺之前一定要用酒精噴一遍，包括一切實(shí)驗(yàn)耗材、儀器、以及你帶著手套的手。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對實(shí)驗(yàn)臺的消毒。紫外什么的，用前用后都照個 30 分鐘。
19、不管買的細(xì)胞、惠贈的細(xì)胞，剛拿到手趕緊做兩件事：檢測是否有支原體污染； 迅速擴(kuò)增凍存。
20、發(fā)現(xiàn)有污染迅速處理掉，特別是當(dāng)你養(yǎng)了很多種細(xì)胞時； 細(xì)菌污染，真菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，支原體污染的話，細(xì)胞會長的慢，買個支原體檢測的 kit 定期檢測一下。
21、細(xì)胞只要是被細(xì)菌污染了，不管用PBS沖洗多少遍，無論是否用高濃度抗生素處理多久，只要抗生素一撤，污染的細(xì)菌必會暴發(fā)，唯1能做的就是扔掉這盤細(xì)胞。
22、非常珍貴的腫瘤細(xì)胞被細(xì)菌污染了并且沒有凍存?zhèn)浞菰趺崔k？可以嘗試小鼠皮下接種，待皮下接種成功后，取下腫瘤消化繼續(xù)培養(yǎng)，小鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)會清理掉細(xì)胞中污染的細(xì)菌。
23、如果細(xì)胞反復(fù)污染，記住一定不是操作問題，一定是有污染源，請仔細(xì)尋找污染源：培養(yǎng)基、血清、胰/酶、培養(yǎng)瓶…，可以提取上述試劑在新的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察哪一組能培養(yǎng)出細(xì)菌。最/簡單粗暴但又快捷的方法就是將所有的細(xì)胞培養(yǎng)的試劑和器皿換成新的。
細(xì)胞污染是非常頭疼的一件事情，祝大家細(xì)胞培養(yǎng)順利！
