實(shí)驗(yàn)概要：本實(shí)驗(yàn)通過搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)分別小量和大量誘導(dǎo)菌種表達(dá)，獲得了目的蛋白的粗提物，通過Amylose親和層析獲得純化蛋白。
主要試劑：LB培養(yǎng)基，2-YT培養(yǎng)基，誘導(dǎo)劑IPTG，5N氫氧化鈉，2N鹽酸，葡萄糖
主要設(shè)備：恒溫振蕩器，離心機(jī)，發(fā)酵罐
實(shí)驗(yàn)材料：重組菌
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 搖瓶培養(yǎng)
1) 取出4℃下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37℃,300r/min,恒溫振蕩培養(yǎng),過夜活化;
2) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100m1 2-YT培養(yǎng)基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)，作為2L搖瓶培養(yǎng)的菌種。
3) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含400m1 2-YT培養(yǎng)基(含有Amp 100ug/ml)的2L的搖瓶中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)。
起始誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌體OD600=4，誘導(dǎo)劑IPTG (IPTG貯液:濃度為20%, 0.22um膜過濾除菌，分裝后-20℃凍存。)濃度為0.03 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間控制在4h左右。
2. 5L發(fā)酵罐培養(yǎng)
1) 取出4℃下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)。過夜活化;
2) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100ml 2-YT培養(yǎng)基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37℃, 300r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)，作為5L發(fā)酵罐的菌種。
在基因工程菌株5L高密度發(fā)酵過程中，溫度由系統(tǒng)自動控制在37℃，通過自動流加5N氫氧化鈉和2N的鹽酸使pH保持在7左右，葡萄糖的流加采用恒速流加，即培養(yǎng)5h后開時(shí)流加補(bǔ)料，以0.042g. (L. min)-1葡萄糖的的速率進(jìn)行補(bǔ)料。發(fā)酵的IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)均為OD600約為3時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的濃度為0.1 mg/ml。
3. 目的蛋白粗提物的獲得
1) 試劑配制
CB(Column Buffer)緩沖液:
Tris-HCl 20mmol/L(pH 7.4)
NaCI 200mmol/L
ED TA 1 mmol/L
PH 7.4
稱11.7g NaCI, 0.37g EDTA,取20ml Tris-HCl，用NaOH調(diào)至PH7.4，加超純水至1L，用0.22um濾膜濾菌。
2) 提取方法
發(fā)酵液以8 000r/min離心30min收集菌體。菌體收集后用無菌水洗二遍，以洗去表面殘留的培養(yǎng)基。按1:10的比例(W/V)把菌體懸浮在CB溶液中，超聲波破碎細(xì)胞，功率40W，每破碎l0s后間隔2s，每5min取樣，用Bradford法測定可溶性蛋白總量，確定最佳破碎時(shí)間。破碎過程中保持低溫(0℃)，*破碎后于4℃以10 000 r/min離心30min，上清液用于上柱純化。
4. Amylose親和層析
1) 試劑配制
a. CB(Column Buffer)緩沖液同上
b. CB加麥芽糖(10mmol/L ):稱取3.6g麥芽糖，用CB配成1L溶液，用0.22um濾膜濾菌;
c. 0.1%SDS:稱1g SDS，加超純水至1L，用0.22um濾膜濾菌。
2) 層析步驟
a.柱子的清洗:先用20%酒精潤洗柱子2次，裝柱;
b.柱子的平衡:新柱料用5倍體積的CB洗柱，再生柱料用3倍體積的CB平衡，流速為2m1/min;
c. 上樣:流速為0.5ml/min;
d. 洗雜:用CB洗柱至流出液的A值與空白(即CB)相同，流速為2ml/min;
e. 洗脫:用CB加麥芽糖洗脫，流速為0.5ml/min，分步收集產(chǎn)品進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定最佳洗脫條件;將接下的樣品取一小樣，留做檢；
f. 柱料的再生:依次用3倍柱體積的無菌水、3倍柱體積的0.lmmol/L SDS溶液、1倍柱體積的無菌水洗柱，各步均須洗至基線;再用3倍柱體積的CB平衡柱料;
g. 純化后樣品，用去離子水透析脫鹽或Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽，經(jīng)低溫真空離心濃縮機(jī)抽干成粉狀，低溫干燥保存。
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