基因表達(dá)載體是廣大科研人員普遍需要的研究工具，而病毒載體憑借其優(yōu)良效能則越來(lái)越成為最shou歡迎、也最為普遍的基因表達(dá)載體。然而病毒載體也分為好幾類，不同實(shí)驗(yàn)類型、不同研究目的、不同“受體”性質(zhì)需要我們準(zhǔn)確評(píng)估與選擇。因此，詳細(xì)了解不同病毒載體的相關(guān)知識(shí)是我們科研人員必須掌握的。本文詳細(xì)介紹了常見病毒載體的原理、特點(diǎn)和適用范圍。
 

　　一、慢病毒載體慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，有由于其感染潛伏期較長(zhǎng)，臨床癥狀發(fā)展緩慢，被稱為慢病毒。而慢病毒載體則是在慢病毒的基礎(chǔ)上改變重組其構(gòu)成原件，進(jìn)而在去除其生物危害性的同時(shí)，利用其高感染等性能表達(dá)目的基因。人類免疫缺陷病毒(HIV)是常見的慢病毒載體改造原型。如下以HIV中最為常見的HIV-1型：
 

　　HIV-1為雙鏈RNA病毒，主要組分包含三種重要病毒核心基因：gag(編碼結(jié)構(gòu)蛋白或稱為核心蛋白)，pop(編碼復(fù)制相關(guān)酶類)，env(編碼包膜糖蛋白)；調(diào)節(jié)基因：tat(轉(zhuǎn)錄控制)和rev(表達(dá)調(diào)節(jié))；四個(gè)輔助基因：vif、vpr、vpu、nef(作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染)；兩端為長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR (內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件)。
 

　　第一代慢病毒載體為雙質(zhì)粒系統(tǒng)，基本保留了HIV的所有組件，產(chǎn)毒滴度低，復(fù)制缺陷，且存在產(chǎn)生復(fù)制能力的活性HIV病毒的可能；第二代慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng)，分為包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和載體質(zhì)粒，其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因替代env基因，拓寬了病毒的感染宿主細(xì)胞范圍，雖然三質(zhì)粒降低了病毒重組的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附屬基因，產(chǎn)生活性HIV依然存在可能；第三代慢病毒載體則去除了HIV病毒所有輔助序列，只保留核心的3個(gè)基yin(gag、pol、rev)，病毒RNA不能轉(zhuǎn)錄，故意外重組的可能性很低；第四代慢病毒載體為四質(zhì)粒系統(tǒng)，即將病毒核心基因分散在多個(gè)質(zhì)粒中(pGag/Pol、pRev、pVSV-G和載體質(zhì)粒)，同時(shí)去除tat，故病毒重組、產(chǎn)生活性病毒的可能進(jìn)一步降低，同時(shí)四質(zhì)粒系統(tǒng)中的載體質(zhì)粒中可以包含可誘導(dǎo)基因，使得該基因表達(dá)系統(tǒng)可以條件性調(diào)控。
 

　　慢病毒載體感染能力強(qiáng)、且宿主廣泛(分裂和非分裂細(xì)胞)；能夠整合進(jìn)宿主DNA且篩選后穩(wěn)定遺傳；表達(dá)潛伏期短，一般細(xì)胞24h-48h、體內(nèi)96小時(shí)可表達(dá)；慢病毒載體可以插入組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子；慢病毒攜帶基因的長(zhǎng)度大致無(wú)5kb以內(nèi)。由于慢病毒依然是HIV來(lái)源，自然宿主是人，依然存在潛在的生物毒性，故操作時(shí)避免直接接觸人體。慢病毒載體適合常見類型的體外研究(細(xì)胞)，包括過表達(dá)、敲除、敲低都基因干預(yù)操作，但慢病毒載體不適合于體內(nèi)研究，因?yàn)槠涞味炔荒軌驖M足體內(nèi)用量且免疫原性較強(qiáng)。
 

　　二、腺病毒載體腺病毒(Adenovirus)是一種線性無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，腺病毒的衣殼結(jié)構(gòu)可以分為五鄰體和六鄰體兩部分，腺病毒的基因組主要包括病毒DNA復(fù)制前期的Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4(編碼病毒調(diào)節(jié)蛋白)和DNA復(fù)制后期的Ll～L5(編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白)，以及兩端的反向重復(fù)序列，ITRs(包裝所必需的順式作用元件)。
 

　　在天然腺病毒(主要是人5型腺病毒)的基礎(chǔ)上改造而得的腺病毒載體，其基因攜帶量增加，感染效率增加，且生物毒性降低。第一代腺病毒載體是刪除Ela、Elb基因的復(fù)制缺陷病毒，其復(fù)制必須在表達(dá)E1蛋白的細(xì)胞中，病毒滴度高且穩(wěn)定，不整合宿主基因組，但包裝量少(約為4.5kb)，免疫原性強(qiáng)；第二代腺病毒載體進(jìn)一步刪減病毒原有基因，在減少免疫原性和細(xì)胞毒性的同時(shí)，進(jìn)一步提高載體容量，可以達(dá)到14kb，但是病毒滴度較低；第三代腺病毒載體則只保留了ITRs和包裝信號(hào)序列，因此其攜帶外源基因容量更大，約36 kb，但由于病毒包裝基因必須基因被刪除，第三代腺病毒載體工作組裝需要輔助病毒(表達(dá)腺病毒裝配必須基因)，第三代腺病毒載體容量大，免疫原性低，但是量產(chǎn)困難，存在輔助病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。
 

　　腺病毒感染力強(qiáng)、宿主范圍廣(分裂和非分裂細(xì)胞)，表達(dá)迅速(24h-48h)且表達(dá)量高，包裝容量大，但腺病毒不能整合入宿主基因組內(nèi)，規(guī)避了整合入宿主基因組的生物風(fēng)險(xiǎn)，安全的同時(shí)也形成了細(xì)胞分裂過程中不能均等分配給子細(xì)胞。腺病毒載體適合一般體外實(shí)驗(yàn)，使用細(xì)胞類型較多，免疫原性較強(qiáng)，不適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
 

　　三、腺相關(guān)病毒腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)是無(wú)包膜單鏈線狀DNA 缺陷型病毒，外包二十面體衣殼蛋白，基因組包括兩端的反向重復(fù)序列ITR(包含復(fù)制和包裝所需的唯1順式作用元件)，中間的兩個(gè)核心基因：Rep 基因(編碼參與病毒復(fù)制、包裝和基因整合的蛋白)，Cap(編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3)。AAV為復(fù)制缺陷病毒，不能獨(dú)立存在，其復(fù)制增殖需要輔助病毒作用。衣殼蛋白不同的AAV病毒，對(duì)組織器官的親和力不同，形成各種AAV血清型：如AAV1較易感染骨骼肌，AAV6較易感染肺部，AAV8則親嗜肝臟，AAV9則為神經(jīng)和外周組織(見后表)。
 

　　腺相關(guān)病毒載體(重組腺相關(guān)病毒載體, rAAV)的發(fā)展同樣在天然AAV的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化改進(jìn)。最早采用重組載體質(zhì)粒、目的基因質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、腺病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，步驟多、產(chǎn)率低、風(fēng)險(xiǎn)高；隨后采用目的基因載體、AAV基因載體(rep/cap)、輔助質(zhì)粒(包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似輔助功能的基因元件)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但包裝效率低，生物風(fēng)險(xiǎn)高；Ad/AAV嵌合載體、輔助質(zhì)粒感染恒定表達(dá)Rep/Cap細(xì)胞系的方法以及AAV生產(chǎn)細(xì)胞系法，這些方法均操作繁瑣；目前最chang用的載體方法為Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)：將rAAV包裝組分AAV2的Rep基因序列、Cap基因序列、以及ITR-目的基因表達(dá)框的序列分別構(gòu)建到三個(gè)桿狀病毒中，分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9各自擴(kuò)增，然后通過共感染Sf9細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)rAAV，該方法可以量產(chǎn)、成本低、操作簡(jiǎn)單且不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生損傷。
 

　　AAV載體免疫原性極低，非常適合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，感染效率高，宿主范圍廣(分裂和不分裂細(xì)胞)，不整合到基因組，穩(wěn)定表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(半年以上)，但是表達(dá)水平低且慢(細(xì)胞需要1周，動(dòng)物需要2周)，攜帶目的基因片段約為2kb。