必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。
 

　　細(xì)胞復(fù)蘇步驟
 

　　一.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
 

　　將水浴鍋預(yù)熱至37℃。
 

　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75%酒精擦拭并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面。
 

　　在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等。
 

　　二.取出凍存管：
 

　　根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。
 

　　從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。
 

　　三.迅速解凍：
 

　　迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動，使管中的液體迅速融化。
 

　　約1-2min后凍存管內(nèi)液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
 

　　四.平衡離心：
 

　　用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中1000r/min，離心5min。
 

　　五.制備細(xì)胞懸液：
 

　　吸棄上清液。
 

　　向離心管內(nèi)加入10ml預(yù)熱的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
 

　　用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 

　　六.細(xì)胞計數(shù)：
 

　　細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。
 

　　七.培養(yǎng)細(xì)胞：
 

　　將符合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定。
 

　　八. 記錄復(fù)蘇日期：
 

　　細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面容易出問題的部分，因此必須注意以下幾點(diǎn)~
 

　　注意無菌操作。
 

　　取細(xì)胞的過程中可能會接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。
 

　　此項(xiàng)尤為重要，如果凍存管密封不嚴(yán)，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸，所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套，復(fù)蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。
 

　　應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)溫速度太慢，則會造成細(xì)胞損傷。另外，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作Hao在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。
 

　　復(fù)蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮取出的細(xì)胞在短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
 

　　離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細(xì)胞的損傷。
 

　　細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時1ml細(xì)胞液要加10ml-15ml培養(yǎng)液，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。
 

　　復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。
 

　　加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會比較大，就會影響細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響。還有一個說法是1%。所以如果凍存液的濃度是10%DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。
 

　　初學(xué)者易犯的錯誤：
 

　　水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。
 

　　水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。
 

　　離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。
 

　　一次復(fù)蘇細(xì)胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
 

　　解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會造成細(xì)胞生長不良，甚至死亡，像水土不服一樣。
 

　　結(jié)果分析：
 

　　判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率)。如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長，達(dá)到正常的生長特性(比如細(xì)胞群體倍增時間等)后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲存數(shù)量。