成功的ELISA方法的開發(fā)關(guān)鍵，在于對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑耗材的選擇和搭配。
對(duì)試劑耗材的特性和多樣性的了解，有助于在不同的實(shí)驗(yàn)需求中尋找合適的組合搭配中開發(fā)高質(zhì)量的ELISA方法。
①酶標(biāo)板材：
市面上提供的酶標(biāo)板材基本都是多聚苯乙烯，產(chǎn)品線比較齊全的公司會(huì)對(duì)多聚苯乙烯材質(zhì)的多種化學(xué)修飾以相對(duì)于包被的蛋白具有不同的特性。
一般的酶標(biāo)板材的說明書上會(huì)根據(jù)高結(jié)合力（Highbinding），中結(jié)合力（mediumbinding）的維度進(jìn)行劃分。
但筆者以多年的從業(yè)經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，會(huì)更信任以親水，弱親水，未處理和疏水四個(gè)等級(jí)劃分酶標(biāo)板材的類型和特性的酶標(biāo)板材。
一般來說，酶標(biāo)板材由親水到疏水，對(duì)蛋白的結(jié)合會(huì)由強(qiáng)逐漸變?nèi)?，這會(huì)帶來三個(gè)效果：
相同濃度的蛋白包被，結(jié)合能力強(qiáng)的比結(jié)合能力弱的材料可以在酶標(biāo)板材上固定更多的蛋白，因?yàn)閱慰子H水板材的大吸附抗體量是220ng，而疏水板材只有100ng。
由親水到疏水，板材對(duì)包被蛋白的吸附效率提高的同時(shí)，其對(duì)ELISA反應(yīng)過程中樣品蛋白、樣品溶液中的其他蛋白和酶聯(lián)抗體的非特異吸附的能力也會(huì)提高，從而造成非特異信號(hào)。
包被的蛋白作為一個(gè)大分子以一個(gè)表面吸附在酶標(biāo)板材上，其表面在不同酶標(biāo)板材上并不是大多數(shù)人想象中的隨機(jī)均勻的，有明顯的偏向性，會(huì)導(dǎo)致在不同的特性酶標(biāo)板材上，包被蛋白與酶標(biāo)板材的接觸表面不一樣，從而造成不同的位點(diǎn)被屏蔽的現(xiàn)象。如果這個(gè)位點(diǎn)恰好是與檢測(cè)樣品結(jié)合的位點(diǎn)，樣品將會(huì)因此無(wú)法被檢測(cè)到。
所以一個(gè)專注多樣化ELISA方法開發(fā)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該準(zhǔn)備多種不同特性的酶標(biāo)板材以供選擇。
②包被液：
常用的包被液是PBS（pH 7.4）或者碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液pH 9.6，pH和離子濃度會(huì)對(duì)包被的效率產(chǎn)生一定的影響，需根據(jù)包被蛋白的特性進(jìn)行具體分析，包被蛋白溶液經(jīng)過包被后也不會(huì)都吸附在酶標(biāo)板材上，包被完成后大部分蛋白還是留在溶液中。
文獻(xiàn)中有記載蛋白溶于包被液后抽真空使包被蛋白以更高的密度吸附在酶標(biāo)板材上的案例。
③封閉劑：
常用的封閉劑有3%BSA（w/v），5%脫脂奶粉（w/v）等。
封閉液的作用是覆蓋酶標(biāo)板材包被蛋白占據(jù)位置以外的空間，以抵抗后續(xù)樣品或者樣品中的其他物質(zhì)、酶聯(lián)抗體等對(duì)于板材直接的非特異吸附。
根據(jù)筆者多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，封閉劑只能對(duì)成分簡(jiǎn)單的樣品溶液起到較好的封閉作用但面對(duì)成分比較復(fù)雜的樣品溶液，封閉效果則會(huì)大打折扣。
有研究表明，封閉劑的封閉效果和封閉分子的大小成反比，所以如果傳統(tǒng)的封閉劑起不到很好的封閉效果，選用分子量更小的封閉劑（如：酪蛋白），可能會(huì)取得更好的封閉效果。
另外需特別注意：如果檢測(cè)體系是生物素-鏈霉親和素體系，千萬(wàn)不要使用脫脂奶粉作為封閉劑——因?yàn)槊撝谭壑泻猩锼?，?huì)對(duì)檢測(cè)體系造成干擾。
④洗滌液/稀釋液：
常用的洗滌液是中性的緩沖液加上一定濃度的去污劑如PBST (0.05%(V/V) Tween-20 in PBS)。
稀釋液會(huì)在洗滌液中加入一定的封閉劑成分如0.5%BSA (W/V ) in PBST。
在一些體內(nèi)樣品的檢測(cè)過程中，通常會(huì)在稀釋液中加入一定濃度的陰性血清，以使得不同稀釋度的樣品有相同的非特異背景。
⑤酶聯(lián)抗體：
酶聯(lián)抗體的種類很多，可根據(jù)抗體的作用位點(diǎn)分為特異性酶聯(lián)抗體和通用型酶聯(lián)抗體。
特異性酶聯(lián)抗體作用于特定蛋白的表位上。
通用型酶聯(lián)抗體則往往針對(duì)于多肽序列組成的標(biāo)簽，生物素，特定種屬抗體的Fc端保守區(qū)域等。
常用的酶聯(lián)抗體標(biāo)記的酶主要為AP（堿性磷酸酶）和HRP（辣根過氧化氫酶）。
酶聯(lián)抗體根據(jù)其抗體的成分可分為單抗酶聯(lián)抗體和多抗酶聯(lián)抗體。
其中多抗酶聯(lián)抗體的多抗成分一般是通過免疫兔或者山羊得到的，成分比較復(fù)雜，需格外注意其與ELISA體系中其他試劑的交叉反應(yīng)。
酶聯(lián)抗體根據(jù)其抗體的分子量由大到小可分為全長(zhǎng)的酶聯(lián)抗體、Fab片段酶聯(lián)抗體、scFv酶聯(lián)抗體。
分子量越小的酶聯(lián)抗體越有可能避免和樣品蛋白結(jié)合時(shí)可能存在的作用位點(diǎn)被空間阻礙的情況，但也進(jìn)一步增加了酶聯(lián)抗體繞過封閉劑的阻斷與酶標(biāo)板材進(jìn)行非特異結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。
⑥顯色液和酶標(biāo)儀：
顯色液的選擇需與酶聯(lián)抗體的酶對(duì)應(yīng)，也需和實(shí)驗(yàn)室所具備的酶標(biāo)儀對(duì)應(yīng)。
如酶聯(lián)抗體偶聯(lián)的是HRP（辣根過氧化氫酶），可以采用TMB顯色液，用能夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)；
或者Ampliflu™Red為底物，用能夠進(jìn)行熒光讀數(shù)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)；亦或采用QuantaRedADHP為底物，用能夠進(jìn)行化學(xué)發(fā)光讀數(shù)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。
一般來說，ELISA方法的靈敏度會(huì)受到底物的檢測(cè)方法限制，化學(xué)發(fā)光底物能夠檢測(cè)的信號(hào)下限要優(yōu)于熒光底物，再優(yōu)于吸光度值底物。
即使是常用的TMB顯色液，很多供應(yīng)商不同顯色強(qiáng)度的顯色液，可以根據(jù)方法開發(fā)過程的具體情況合理選擇顯色液。
