在細胞培養(yǎng)實驗過程中，大家是不是總會好奇別人家的實驗總是做的又快又好，而自己做的實驗又慢又難得做出自己滿意的結(jié)果，搞得一天到晚也挺忙的，心想：我也很努力很認真啊，為啥效率總提不起來呢？
其實，有時候并不是自己不努力，只是沒有找對方法。做實驗可不能光是埋頭苦干，還要學會運用合適的檢測試劑盒，這樣就能事半功倍。
如果你還在用 MTT，那就真的 OUT 了，MTT 花 4 小時才能得到的結(jié)果用 CCK-8 只需 1 小時，CCK-8 可用于細胞增殖和毒性分析，同 MTT 法相比，CCK-8 即開即用，檢測時間大概在 1 小時左右。
不僅如此，CCK-8 對細胞的毒性極小，*可以測完細胞增殖或藥物毒性后再繼續(xù)用細胞進行下游實驗。下面小編就來為大家介紹一下 CCK-8 的具體情況。
CCK-8 基本原理
基本原理為：該試劑中含有 WST-8【化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2 H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
圖 1. WST-8 檢測原理圖 EC=electron coupling reagent，即電子耦合試劑)
圖 2. CCK-8 檢測細胞活性原理圖
產(chǎn)品用途
主要用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。
細胞毒性檢測的實驗對比
表 1. 細胞毒性檢測的實驗對比
CCK-8 的實驗方法與步驟
☆實驗一：細胞活性檢測
1. 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待測細胞調(diào)密度至 （1,000~10,000）/ 孔。
2. 5% CO2，37℃ 培養(yǎng)細胞 24 小時（培養(yǎng)時間根據(jù)細胞種類的不同和每孔內(nèi)細胞數(shù)量的多少而異）。
3. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為 200 μL，則需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情況以此類推。
4. 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5~4 小時，對于大多數(shù)情況孵育 1 小時就可以了。時間的長短根據(jù)細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定（一般情況下，白細胞較難顯色，因此需要較長的 CCK-8 反應(yīng)時間或增加細胞數(shù)量。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于貼壁細胞，CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 1~4 小時，注意：CCK-8 的jia反應(yīng)時間以具體顯色的jia時間為準）。初次實驗時可以在 0.5、1、2 和 4 小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。
5. 在 450 nm 測定吸光度。
☆ 實驗二： 細胞增殖 - 毒性檢測
1. 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待測細胞調(diào)密度至 （1,000~10,000）/ 孔。
2. 5% CO2，37℃ 培養(yǎng)細胞 24 小時（培養(yǎng)時間根據(jù)細胞種類的不同和每孔內(nèi)細胞數(shù)量的多少而異）。
3. 加入 10 μL 不同濃度的待測物質(zhì)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間 （例如 6、12、24 或 48 小時）。
4. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為 200 μL，則需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情況以此類推。
5. 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5~4 小時，對于大多數(shù)情況孵育 1 小時就可以了。時間的長短根據(jù)細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定（一般情況下，白細胞較難顯色，因此需要較長的 CCK-8 反應(yīng)時間或增加細胞數(shù)量。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于貼壁細胞，CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 1~4 小時，注意：CCK-8 的jia反應(yīng)時間以具體顯色的jia時間為準）。初次實驗時可以在 0.5、1、2 和 4 小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。
6. 在 450 nm 測定吸光度。
圖 3. 實驗操作示意圖
☆ 注意事項：
如果待測物質(zhì)有氧化還原性，可在加 CCK-8 之前更換新鮮的培養(yǎng)基，去掉待測物質(zhì)的影響。
☆ 計算公式：
細胞存活率 = [（實驗孔 — 空白孔）/ （對照孔 — 空白孔）] × 100%
抑制率 = [（對照孔 — 實驗孔） / （對照孔 — 空白孔）] × 100%
實驗孔 （含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測物質(zhì)）
對照孔 （含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測物質(zhì)）
空白孔 （不含細胞和待測物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8）
注意事項
1. 次做實驗時，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間。
2. 接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數(shù)量不一致。
3. 培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā)，為減少誤差，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。
4. 建議采用多通道移液器，減少平行孔間的誤差，加 CCK-8 時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，干擾 OD 值。
5. 若細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8，含有酚紅的培養(yǎng)基不影響測定。
6. CCK-8 對細胞的毒性非常低，其他的實驗，例如中性紅法或結(jié)晶紫法 ，也可在 CCK-8 法檢測完后繼續(xù)進行。
7. 可以使用大于 600 nm 的波長，例如 650 nm，作為參考波長進行雙波長測定，CCK-8 在參比波長處沒有吸光值，設(shè)定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。
8. 如果實驗中待測物質(zhì)有氧化還原劑，在不含細胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入 CCK-8 試劑在一定時間內(nèi)檢測，和不加藥物的培養(yǎng)基進行比較 （只加 CCK-8 試劑），如果 OD 值明顯偏高，則說明有反應(yīng)。
9. 加 CCK-8 試劑時速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入 CCK-8 試劑后輕輕震培養(yǎng)板，為了避免加樣時由于 CCK-8 殘留在槍頭上所帶來的誤差，可以在加樣前用培養(yǎng)稀釋 CCK-8 試劑并混勻后加樣。
10. CCK-8 反復(fù)凍融會增加背景值，干擾實驗測定。
CCK-8 常見問題解答
☆ CCK 的保存和穩(wěn)定性如何？
答：CCK 穩(wěn)定性高，避光條件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。經(jīng)常使用建議 4℃ 保存，避免反復(fù)凍融。CCK 正常顏色為粉紅色，若顏色發(fā)生明顯偏差，質(zhì)量可能有發(fā)生變化。
☆ CCK 會對活細胞進行染色嗎？
答：不會，首先 WST-8 不會進入細胞染色，整個顯色反應(yīng)都是在培養(yǎng)體系中進行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都屬于高度水溶性組分，反應(yīng)結(jié)束更換新的培養(yǎng)液，即可清除外源組分。
☆在加入 CCK-8 時可否不更換培養(yǎng)基？
答：一般情況下可以不更換培養(yǎng)基。但是如果培養(yǎng)基里有氧化還原性物質(zhì)的話，有可能會產(chǎn)生誤差，必須更換其它培養(yǎng)基。
☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板進行試驗，CCK 試劑使用量怎么樣呢？
答：如果要使用 6 孔板或 24 孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK 溶液。
☆ 能否用 384 孔板進行細胞增殖與活性檢測的實驗?zāi)兀?/strong>
答：可以，CCK-8 產(chǎn)品的使用量為每孔培養(yǎng)基總體積的 10%。建議先將 CCK-8 產(chǎn)品稀釋一倍，然后加入培養(yǎng)基總體積的 20% 即可，這樣可減少誤差。
☆ 只可以在 450 nm 波長處測 OD 值嗎？
答：可以在 450 nm 波長處測 OD 值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在 430~490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度高。
☆ 若是暫不檢測 OD 值，該如何處理？
答：若暫時不測定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化
☆ 在實驗中 OD 值太高，怎么解決？
答：可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間由 2 小時縮短為 1 小時。此外，可適當減少細胞的數(shù)量。
☆ 如果 OD 值太低，怎么解決？
答：可以采取 2 個辦法：1、適當增加細胞數(shù)量；2、延長加入 CCK-8 試劑后的反應(yīng)時間。
☆ 應(yīng)該每次做標準曲線嗎？
答：建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。
