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遠(yuǎn)慕生物—PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用
點(diǎn)擊次數(shù):1312 更新時(shí)間:2016-07-25

    遠(yuǎn)慕生物—PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用


    一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />    1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。
    2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。


    二、實(shí)驗(yàn)原理
    PCR技術(shù),即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)是由美國(guó)PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍,這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義,極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù),而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


    PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相似的技術(shù),其結(jié)果都是以原來(lái)的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng),基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似,但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。
    PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
    ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;
    ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;
    ③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。


    重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。


    三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材
    模板DNA、2.5mmol/LdNTP
    TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物
    10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O
    PCR儀、移液槍、PCR板
    四、實(shí)驗(yàn)步驟
    1、配制20μL反應(yīng)體系,在PCR板中依次加入下列溶液:
    模板DNA2μL
    引物11μL
    引物21μL
    dNTP1.5μL
    MgCl22μL
    10×buffer2μL
    ddH2O10μL
    Taq酶0.5μL
    2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。
    3、上樣,啟動(dòng)反應(yīng)程序。
    4、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。

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